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RNA提取是RT-qPCR实验成功的敲门砖，RNA的质量直接关乎整个RT-qPCR实验的成败。但翻车总在不经意间，其实主要的原因在于RNA的分子结构的不稳定性、环境中无处不在的RNase以及环境温度对RNA 的降解造成的加速作用，那么如何提取出高质量的RNA呢，小编给你以下建议：

1. 样本的选择：

我们进行RNA提取的样本最好选择新鲜的细胞样本和组织样本;

2. 样本的采集和保存：

Tips:

为了避免环境中的RNase污染，实验前应将实验台面用75%酒精消毒，实验过程全程佩戴口罩、手套等。实验过程使用枪头及EP管等耗材应为RNase-free处理过的，处理不同组织样本时应对剪刀和镊子进行多次消毒，防止样本间的干扰和污染。

为了避免RNA降解，实验过程要尽量处于低温环境，研磨仪适配器应经过-80冷冻处理；如您是手动研磨，建议在研钵中加入液氮后再手动研磨组织或细胞。如果不能确定RNA是否存在降解现象，可进行琼脂糖凝胶电泳判断RNA是否完整及RNA是否存在降解问题，注意跑RNA琼脂糖凝胶电泳跑胶时间不宜过长，若时间过长因跑胶装置产热也会造成RNA降解。对于真核生物来说，完整的RNA应该有三条带，分别是28S、18S及5S，28S与18S的条带亮度之比应为2:1（如图所示）。若发现5s条带亮度很高且28s和18s的条带呈弥散状态，证明RNA已发生严重降解，建议重新进行RNA提取。

不知道大家是否遇到过qPCR内参循环数差距太大的情况呢，这里建议大家qPCR的实验中不同样本内参的循环数差异不要超过2个循环，那如果遇到内参不齐这种情况应该怎么办呢？这里小编给你以下建议:

1. 内参不齐(个别cDNA的样本与其他cDNA的样本内参CT值差异在2个循环以上)，可将CT值差异较大的cDNA做不同梯度的倍比稀释进行qPCR，选择CT值差异小于2个循环的cDNA稀释倍数进行实验。一般情况下cDNA稀释一倍，CT值会增大1个循环左右，注意qPCR的正式实验时内参也要整齐呦。

2.将RT完毕的cDNA进行同倍体积的稀释，并将cDNA分装使用，这一步骤是为了减少枪头和吸取的微量cDNA的细微差异而造成的误差，提高三复孔重复性。

如果某基因第一次扩增，CT值就大于30甚至无法扩增出来，这种情况可能是扩增效率低导致的，也有可能是该基因在待测样本中的表达丰度低。那么遇到这种情况我们应该如何处理呢？

1. 引物质量差：

无法扩增出来这种情况有可能是引物质量差造成的，建议更换引物进行尝试，或者改用灵敏度高的PCRmix来进行实验。

2. 表达丰度低：

针对表达丰度较低的基因，小编建议可以通过提高模板量来改善CT值偏大的问题，比如可以尝试使用一步法来进行实验。在qPCR实验前小编建议大家在网站中查询该基因的表达情况（https://www.uniprot.org/）提前设计适合的试验方案。

3. 扩增产物过长：

扩增产物长度最好不要超过300bp，如果扩增产物过长建议 大家将两步法程序改为三步法进行实验，这样扩增曲线会有一定程度改善。

熔解曲线备用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，而异常熔解曲线会出现双峰，杂峰等情况~

1. 双峰，杂峰Tm在80℃之前

可能存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化；也有可能是模板量偏低，促使引物二聚体的形成，建议重新制备纯度较高的cDNA。

2. 双峰，杂峰Tm在80℃之后

引物特异性过低造成非特异性扩增，建议重新设计引物改善特异性，设计后建议用blast验证引物特异性是否良好。

3. 尝试许多方法双峰、杂峰仍无法改善

出现这种情况建议您更换识别能力强，条件兼容性更高的PCR试剂，以我们的实际经验来看，mix的不同会对PCR的结果有不同程度的影响，针对表达丰度低的基因，改变mix会有一定程度的帮助。在这里建议大家在RT-qPCR的实验中不要耗费过多的精力，找到稳定的实验试剂即可。

以上就是小编为大家整理的RT-qPCR实验中常见的问题及具体的处理方式和建议，如果您有其它疑问，欢迎联系我们~

总而言之，qPCR实验从RNA提取到反转定量虽步骤简单，但问题也是层出不穷，希望大家在遇到问题时不要慌乱，找到适合自己的解决方法实验才能稳步进行。在这里天津舍为斯生物技术有限公司，为各位提供专业优质的qPCR实验服务，小编在这里为大家呈现本公司的产品优势，如果感兴趣并且想要了解，欢迎大家来电咨询。

2.RNA质检：对于非新鲜制备样本，RNA提取后均需进行RNA质检工作，以保证后续实验的可信度。

3.实验过程透明真实：最终提供实验过程中RNA提取、逆转录及qPCR过程照片，实验结果可追溯。

RNA提取

逆转录

荧光定量

4、多台高质量荧光定量PCR仪，保证数据的稳定输出。

 5.报告结果详细明确，易于查阅。