双荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于启动子转录活性调控及miRNA靶基因验证等方向研究。
双荧光素酶报告基因检测系统广泛应用于生物学研究中，其方法的稳定性和应用价值主要体现在：在细胞中同时表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，该系统被广泛用于miRNA 靶基因验证以及转录因子结合验证。miRNA 主要通过作用于靶基因的 3’UTR 起作用，可以将目的基因 3’UTR 区域构建至载体中报告基因 luciferase 的后面，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，报告基因表达的改变（监测荧光素酶的活性变化）可以定量反映 miRNA 对目的基因的抑制作用，也可用荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。而大多数转录因子会结合在靶基因的启动子区，我们同样可根据在线预测等方法锁定结合率较高的结合位点，并针对结合位点附近构建双荧光素酶报告基因载体质粒的野生型及突变型，进而通过分析比较萤光素酶的活性变化来判断靶基因与转录因子是否有直接结合。同样的，对于转录元件的研究，也可以针对目的序列部分构建相应的野生型及突变型荧光素酶报告基因载体质粒，通过荧光素酶的活性变化来作为调控作用的直接判定依据。
在一些临床医学或基础医学文章中，双荧光素酶结合验证实验部分是多数机制研究必备的实验部分，在通路研究中，尤其涉及到miRNA与功能基因的相互作用时，双萤光素酶报告基因检测实验是您必备的实验要点。以下是几个双荧光素酶结合验证的文献案例：
1、Circ-ZEB1 promotes PIK3CA expression by silencing miR-199a-3p and affects the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma. 发表期刊：Mol Cancer 影响因子：15.302 发表时间：2022年5月 原文链接：https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01529-5#Fig1
2、An enhancer variant at 16q22.1 predisposes to hepatocellular carcinoma via regulating PRMT7 expression. 发表期刊：Nat Commun 影响因子：12.121 发表时间：2022年5月 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-28861-0
3、LncRNA PKMYT1AR promotes cancer stem cell maintenance in non-small cell lung cancer via activating Wnt signaling pathway. 发表期刊：Mol Cancer 影响因子：15.302 发表时间：2021年12月 原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8638142/
4、Localisation of PGK1 determines metabolic phenotype to balance metastasis and proliferation in patients with SMAD4-negative pancreatic cancer. 发表期刊：Gut 影响因子：19.819 发表时间：2020年5月 原文链接： https://sci-hub.mksa.top/10.1136/gutjnl-2018-317163
5、WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1. 发表期刊：Mol Cancer 影响因子：15.302 发表时间：2019年8月 原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6704583/ 越来越多的研究表明m6A修饰在哺乳动物中发挥重要的生物功能，例如，在转录后水平上调控RNA的稳定性、定位、运输、剪切和翻译，并且已有报道m6A修饰参与了肝癌的肿瘤发生过程。作者发现WTAP在肝癌中高表达，提示预后不良，并可进一步调控m6A修饰，进一步导致ETS1的转录后抑制。通过双荧光素酶报告基因检测实验，对ETS1基因的m6A修饰位点进行突变，分别选择了启动子区及部分CDS区序列的结合位点进行了突变载体的构建，发现野生型报告基因的表达较对照组显著增加，而突变后报告基因的表达受到了抑制，表明了ETS1的转录受WTAP介导的m6A修饰的调控。作者的发现丰富了m6A甲基化在肿瘤标志物中的功能价值，并为探索有效的肝癌治疗策略开辟了潜在的途径。
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