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CUT&RUN是对CHIP实验的革新性技术，其改进点在于观察到核的轻微MNase处理释放单核小体和TF-DNA复合物，留下寡核小体。TF两侧的定向裂解将把TF-DNA复合物释放到上清液中，将剩余的基因组留在沉淀的核中。通过在冰上进行简短的消化反应，我们可以在TF结合的MNase扩散到周边的基因组和裂解可接近的染色质之前在上清中恢复TF-DNA复合物。根据其步骤可以理解其原理为，Concanavalin A或者说是ConA beads被lectin（凝集素）包裹，这个beads可以结合细胞膜/细胞核上的glycoconjugates（糖复合物）。膜是通透的，染色质可以被特异的抗体结合。下一步，加入AG蛋白-micrococcal核酸酶（也叫做pAG-MNase），这个pAG-MNase结合到抗体连接的染色质上，然后通过适量浓度的Ca2+来激活pAG-MNase，从而切割下来被沉淀下来的DNA。被切下来的DNA游离到上清里，通过离心我们可以把这些抗体结合的DNA分离出来。之后提取DNA，可以选择做qPCR，或制备文库后进行测序，进行数据分析。

图1 CUT&RUN原理图

实验开始前首先要全面考虑你的细胞类型、实验条件、对照、抗体，从而完美地解决你的科研问题。细胞数量上，推荐每个样品1—2万个细胞。当然你可以尝试不同的细胞数量来优化你的实验。对于试剂盒来说，一般最少你可以用1000个细胞来进行实验。对照和标准化是整个实验的关键步骤。阳性对照推荐使用H3K4me3或者H3K27me3（当然有些试剂盒中会包含相应阳性和阴性对照）；阴性对照推荐使用Rabbit IgG。当然有些试剂盒中会包含相应阳性和阴性对照。其次，你还可以使用spike-in来进行标准化。以下基本步骤可作为参考。

Beads的活化在1.5ml tube里进行，你还需要与之匹配的magnetic rack。首先震荡beads，然后快速离心一下。接下来把beads放在magnetic rack上，待溶液澄清了，吸走上清。然后用活化buffer清洗重悬，注意活化buffer要放置在冰上。

首先收集你的细胞，用wash buffer清洗细胞两次，最后用wash buffer重悬你的细胞。之后把beads加入到细胞悬液里。轻微震荡或用移液枪吹打。室温静置10分钟。

上一步静置后，把beads放在magnetic rack上，移除上清。加入冷的抗体buffer，这一步要快，防止beads干燥，但是不要太剧烈，防止细胞裂解。然后加抗体，轻微震荡，放在4度摇床上旋转孵育2小时或过夜。

 快速离心样本，把管放在magnetic rack上。待溶液澄清，移除上清。加入冷的digitonin buffer。清洗2遍。清洗后用digitonin buffer重悬beads。pAG-MNase和digitonin buffer应放置在冰上。在样品里加入pAG-MNase，室温孵育10分钟，快速离心，放置magnetic rack上，移除上清。使用digitonin buffer清洗beads两遍。然后用digitonin buffer重悬beads。

把样品放在冰上，加入CaCl2，因为Ca2+会活化pAG-MNase，轻微震荡后，摇床上4度孵育。之后加入stop buffer。如果你想加入spike-in，那么加完stop buffer后可以加入spike-in DNA。之后把管子放在magnetic rack上，把上清液移到新的管里。之后可纯化DNA，继续下游检测。

对纯化后的DNA可进行qPCR或NG-Seq鉴定、定量分析。

CUT&RUN技术虽萌芽不久，但已受到众多科研工作者的青睐，CNS等高分杂志也对该技术给予了积极评价及肯定。目前已有多篇与CUT&RUN技术相关的文献发表在了CNS等高分杂志上。正因为该技术近几年的火爆，CUT&RUN也有望成为蛋白质—DNA互作研究的下一代主流技术。

目前已有多篇文献对该技术和chip技术进行了详细的对比性实验，验证了CUT&RUN技术的优势及准确性。接下来给大家介绍一篇文献，便于大家对CUT&RUN技术有一个详细和深入的了解。

在“Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers”这篇文献里，作者比较了CUT&RUN技术与传统CHIP技术，验证了无论在实验操作可控性，细胞数量要求，还是测序结果信噪比方面，CUT&RUN技术都要比CHIP技术有更多的优势。

图3 CUT&RUN可以检测低至100细胞的H3K27me3基因组分布

图4 用CUT&RUN检测CTCF的结合位点，比ENCODE中的CTCF ChIP-seq对比

了解了CUT&RUN技术的原理，操作步骤，技术优势，您是否已经对它倾心了呢？如果您对该技术感兴趣，而临床或科研工作繁忙，抽不开身尝试的话，天津舍为斯生物技术有限公司现推出CUT&RUN实验半价促销优惠活动（仅限前五名，活动有效期截止：2022年6月30日）供您选择，如果您已动心，就请赶快联系我们吧（tel：15302060382）。