编者说 /
在与大量临床医学科研工作者合作交流过程中，我们发现很多临床医学科研工作者受限于科室条件无法获得临床组织样本做科学研究，而对于易获取的血液样本，如何有效开发利用上，缺乏专业指导和实验方法。比如血液样本的组学实验后期的分子验证、以及血液样本的biomarker筛选，常常都会涉及到RT-PCR实验，由于临床血液样本的特殊性，广大科研工作者在提取RNA过程中，常常面临提取的RNA质量差、总量少或很快降解，以及内参选择不当等常见问题，由此让很多科研工作者对于血液样本的RT-PCR望而却步。
对于上述实验中遇到的问题，天津舍为斯生物技术有限公司经过深入研发和大量实验验证，帮大家找到了血液样本RT-PCR稳定产出的实验方法。今天小编就为大家整理相关的实验方法、注意事项和内参基因的选择技巧，助力更多的临床医学科研工作者顺利完成相关实验。
RNA提取前对血液样本的预处理
很多时候RNA提取失败的主要原因之一就是在采集血液样本后，未对血样进行妥善处理及保存造成的。小编在这里提醒大家，在对全血样本收集后，需要及时加入一定量的保护剂，它能起到保护新鲜血样中的RNA不被降解的功效，这一点很重要，直接关乎整个实验的成败，需要大家格外注意。另外小编建议：在采集完血液样本后立即添加血液样本保护剂并混匀，室温放置一段时间后再冻存，这样能够保证血液样本保护剂更充分的保护血液样本中的RNA不被降解，并保证后续血样在冻存和再复融抽提RNA过程中，RNA都能够得到最大限度的保护。 注：天津舍为斯生物技术有限公司目前对于血液样本的RNA提取已具备较成熟的实验体系，在双方建立合作关系后，会及时与客户沟通交流、技术跟进，并能够保证提取的RNA以及RT-PCR结果的高质量，感兴趣的伙伴可以致电咨询详情（电话见文末，或微信后台留言均可）。
实验细节小Tip
RNA酶在自然界中无处不在，在实验过程中，不规范的操作可能会造成RNA被降解。因此小编提醒大家，在实验操作过程中，要注意勤换手套，选用专用的无RNase枪头，及无RNase的离心管，在样品吸取转移等过程中要及时盖好离心管的盖子，避免RNase污染，另外需要注意，RNA提取过程中尽量使样品全程处于低温环境。
内参基因的选择
RT-PCR是研究基因表达的最佳选择之一，常见的内参基因如β-actin、GADPH、α-Tubulin等，在不同的样本、实验条件下适用性不同，所以选择正确的内参基因对于有效及稳定的数据输出很重要。以下是小编为大家找到的几篇血液样本RT-PCR内参筛选经典文献，供大家参考：
1.《Selection of reference genes for RT-PCR studies in blood of beluga whales (Delphinapterus leucas)》
作者从四只白鲸身上采集了六十份血液样本。使用RT-PCR测试了13个候选内参基因（β-actin，B2M，GAPDH，HPRT1，LDHB，PGK1，RPL4，RPL8，RPL18，RPS9，RPS18，TFRC，YWHAZ）。对结果的全面分析显示，β-actin、RPL4与PGK1在白鲸血液样品的RT-PCR研究中显示出了较强的优势。
2. Validation of reference genes for whole blood gene expression alysis in cord blood of preterm and full-term neonates and peripheral blood of healthy adults》
该篇文献提到：早产是新生儿发病和死亡的主要原因之一，但由于无法获得大量血液样本，新生儿学的研究工作很复杂。全血RT-PCR可用于通过少量血样进行功能基因表达研究来克服这个问题。研究鉴定和验证了适用于不同妊娠年龄组发育中新生儿获得的脐带血样本以及成人外周血样本的内参管家基因。通过不同算法分析了八个内参基因候选者（β-actin，B2M，GAPDH，GUSB，HPRT，PPIB，RPLP0，RPL13）。考虑到内参基因表达的年龄依赖性增加，对新生儿和成人组使用 β-actin/GAPDH 更为合理。
3.《Evaluation and validation of the suitable control genes for quantitative PCR studies in plasma DNA for non‑invasive prenatal diagnosis》
该文作者首先通过对妊娠/非妊娠妇女的血液当中的DNA进行提取，进行qPCR分析，旨在从六种常见的内参基因（HBB，TERT，GAPDH，ALB，β-actin和TRG）中筛选出最可靠的内参基因，以定量来自怀孕和非怀孕女性的血浆DNA，用于非侵入性产前诊断。通过几种不同的算法分析结果，发现不同内参基因的稳定性略有差异，该研究最终结果表明，在本实验中，将TERT以及β-actin和TERT的组合作为妊娠/非妊娠血浆DNA定量PCR研究的最佳内参基因，而GAPDH和TRG在该文献研究中被证明是很不稳定的内参基因。
经过大量的文献考证以及实验验证，推荐大家参考选用β-actin作为内参基因用于血液样本的PCR检测；关于我们的实验验证，给大家做部分结果展示。仅供参考。
内参基因β-actin
目的基因
以上就是小编为大家整理的全血样本RT-PCR实验技巧、注意事项及内参基因选择建议，希望能够为广大临床医学科研工作者提供一些技术支持和帮助，进而为大家能够更好的利用好临床血液样本贡献一份力量。RT-PCR虽然整体过程看上去不难，但是实验步骤繁多，问题也是层出不穷，希望大家在实验过程中积极寻找解决办法，加以解决。天津舍为斯生物技术有限公司竭诚大家提供优质服务，并愿意将更多的宝贵经验与大家进行交流分享（详情请电联，电话见文末，或微信后台留言均可）。
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总而言之，qPCR实验从RNA提取到反转定量虽步骤简单，但问题也是层出不穷，希望大家在遇到问题时不要慌乱，找到适合自己的解决方法实验才能稳步进行。在这里天津舍为斯生物技术有限公司，为各位提供专业优质的qPCR实验服务，小编在这里为大家呈现本公司的产品优势，如果感兴趣并且想要了解，欢迎大家来电咨询（电话：15302060382）。
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