EMSA凝胶阻滞实验原理及应用解析_新闻中心_舍为斯生物-推动生物医学快速发展

简介

1) 概念：Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验，是一种用于研究转录因子和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，能对各类转录因子的DNA结合活性进行定性和半定量分析，是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。

2) 检测原理：EMSA主要基于蛋白-探针复合物在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物。这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快。孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针有互作。

3) 特异性：常用实验技术中免疫组化、免疫印迹 (Western Blotting) 和EMSA均可用于转录因子检测，但三者的侧重点各有不同。免疫组化或免疫荧光技术可以较准确的反应转录因子的表达部位和表达细胞，Western Blotting可以精确定量转录因子。但并非所有转录因子均可以与DNA结合以刺激基因转录，唯有EMSA技术可以反映转录因子是否具有DNA结合活性，故EMSA是证明细胞信号转导通路最终效应的必要实验技术。

4) 应用：可用于验证转录因子与启动子相互作用，也可用于蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用。

实验步骤

1)设计实验方案：根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等；

2)设计探针：根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多；

3)形成蛋白-探针复合物：相应组分添加至0.5mL的离心管后进行冰浴（5min），随后添加1μL探针。在PCR仪中室温（20-23℃）温育30min；

4)制备凝胶电泳、转膜；

5)检测、曝光成像。
6)文献数据展示：

以一篇已发表的题为“Characterization of the promoter of the human farnesyltransferase beta subunit and the impact of the transcription factor OCT-1 on its expression”的研究为例[1]。该文献检测到人类的FTaseβ亚基基因（FNTB）启动子区域在HEK-293和HeLa细胞中显示出显著的基础启动子活性。研究人员在−165 - −70检测到转录因子OCT-1的10个潜在结合位点。三个可以通过EMSA实验得到证实。结果表明OCT-1的过度表达和敲除证实其是FNTB表达的重要调节因子。

7）实验细节：

(a) 看不到迁移带的原因分析?

蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足；样本中没有可以与探针结合的蛋白；探针与蛋白无特异性的相互作用；转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上；曝光或者成像时间过短等。

(b) 实验背景高的原因?

曝光或者成像时间过长；封闭时间不足或者效率不高；洗涤效果不佳；实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在 20～2000 ug 间，用粗制核抽提液，需要 2～10 ug 蛋白形成特异的复合物。部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在 -80 ℃、探针应保存在 -20 ℃ 以防止降解。应注意无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。

(d) 用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？

将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为 6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将 TGE 缓冲液（12.5 mM Tris，pH8.3，95 mM 甘氨酸，0.5 mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA 复合物。在 4 ℃ 进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。

宗旨理念

a. 实验过程及结果能够保证绝对真实，原始数据全部反馈给客户。

b. 实验过程全部有据可循，拍照留存，实验数据能够保证真实有效。

[1] H. Verhasselt, P. Stelmach, M. Domin, D. Jung, A. Hagemann, I. Manthey, H.S. Bachmann, Characterization of the promoter of the human farnesyltransferase beta subunit and the impact of the transcription factor OCT-1 on its expression, Genomics 114 (2022) 110314.