背景介绍
RNA 与蛋白质的相互作用是细胞生理过程得以实现的决定性因素之一。近年来，随着技术的改进和新方法的建立，RNA 和蛋白质的相互作用研究取得了长足进步。目前科研人员已经鉴定了较多 RNA 上的蛋白质结合位点，也发现了许多蛋白质中的 RNA 结合结构域，并对它们的结构特征进行了比较详细的研究。这些为最终探明 RNA 和蛋白质相互作用的分子机制，从而从本质上认识相关的细胞生理过程打下了坚实的基础。
1. 概述：
RNA pull-down 作为研究 RNA 与蛋白互作的核心技术，已成为研究焦点。RNA pull down 是使用体外转录法标记生物素 RNA 探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成 RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过 WB 实验检测特定的 RNA 结合蛋白是否与 RNA 相互作用，或者结合 MS 筛选 RNA 结合的未知蛋白。
2. 基本思路：
研究蛋白质与RNA之间的相互作用，大致有两种思路:①将RNA耦联于珠子以富集与之相互作用的蛋白质; ②用蛋白特异的抗体去免疫沉淀蛋白质，再通过提取蛋白复合体中的RNA，利用QT-PCR等方法以检测与之相互作用的RNA。
3. 应用领域：
RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类功能强大而广泛的调节因子，约占细胞编码的所有蛋白的5%-10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发挥功能，大部分RNA通过与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物来发挥作用。一方面，RBP参与RNA合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内定位等多个转录后调控过程，调控mRNA稳定性、lncRNA活性、miRNA沉默复合体形成等生物学过程；另一方面，RNA也会调节这些蛋白质的活性、定位或与其他蛋白质相互作用，从而影响RBP介导的各种细胞事件。RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的，干扰这种相互作用将会导致细胞功能失调和相关疾病的发生。
实验方法
1.实验步骤：
2.实验细节：
a：在构建RNA过表达质粒的过程中，首先通过一些手段筛选确定自己感兴趣的RNA，检索数据库找到对应的 RNA 碱基序列，通过 RACE 扩增确定是否存在未知序列；其次，确认 RNA pull-down 使用的序列后，设计引物全基因合成目的RNA 序列，并测序验证序列准确性；最后提取过表达质粒备用。
b：以构建过表达质粒为模板，与设计合成好的引物，扩增得到体外转录模板，琼脂糖凝胶电泳检测扩增 PCR 产物情况，切取目的条带纯化回收备用；
c：以纯化回收的 PCR 产物作为转录模板，用体外转录试剂盒进行转录得到目的 RNA；
d：提前准备蛋白液备用，同时将体外转录得到的 RNA ，标记生物素后纯化备用。此外，标记生物素 RNA 探针与链霉亲和素磁珠共孵育形成复合物；生物素 RNA 探针-链霉亲和素磁珠复合物富集蛋白；
e：银染后进行质谱鉴定。
3.案例展示：
以一篇已发表的题为“The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia”的研究为(DOI: https://doi.org/10.1186/s13045-020-00909-y)。研究者们通过大量临床样本的检测发现，一个长链非编码RNA(LncRNA)“LAMP5-AS1”在混合系白血病(MLL)中高表达，因此进一步探索了LAMP5-AS1在MLL白血病发生发展中的作用。通过RNA pull-down结合质谱鉴定技术首次发现了LAMP5-AS1的潜在结合蛋白-DOT1L（一种H3K79甲基转移酶），且通过RIP qPCR实验确定了LAMP5-AS1与DOT1L结合。结果表明lncRNA LAMP5-AS1在MLL白血病细胞的自我更新过程和分化阻滞中起着重要的作用。LAMP5-AS1对维持DOT1L酶在MLL白血病中的高活性具有重要意义，可能成为治疗MLL白血病的一个有价值的靶点。
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