在qPCR实验中，引物设计可谓是相当关键的一个步骤，经常听到做实验的小伙伴们提到自己用到的引物明明来自于文献，可是最终得到的曲线图却不尽人意，或是设计的引物眼花缭乱，无从判断要选择哪一个。引物质量的好坏直接关乎实验结果的成败，下面将为大家详细介绍几种引物设计的方法，这样小伙伴们都可以自己设计引物啦~同时希望能帮大家解决引物特异性差、扩增效率低等让人头疼的问题，为大家的科研道路添砖加瓦。
引物设计原则
引物设计有 3 条基本原则：（1）、引物与模板的序列要紧密互补；（2）、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；（3）、引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度，产物长度，序列 Tm 值 ，引物与模板形成双链的内部稳定性(用 ∆G 值反映)，形成引物二聚体及发夹结构的能值，在错配位点的引发效率，引物及产物的GC 含量等。yashiyan对实
实验细节小Tip
1. 引物的长度一般为 15-30 bp，过长会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。
2. 避免引物 3’端出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC。
3. 引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败。
4. 引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使复性条件最佳。
6. ∆G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3’端 ∆G 值较低（绝对值不超过 9），而 5’端和中间 ∆G 值相对较高的引
物。引物的 3’端的 ∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。
7. 引物最好跨内含子设计，来避免基因组DNA的污染。
引物设计方法
第一步：基因查询
以人的IL-1b基因为例，在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站输入IL-1b基因名称，物种选择人，即可找到对应结果。
第二步：找到CDS区
点击对应基因下拉，找到红色区域后点击进入。进入后点击CDS，继续下拉就会发现对应区域已经被明显选中，点击FASTA格式后复制即可。
第三步：条件限定
打开Primier Primer 6.0软件，将复制的序列一键粘贴到软件的文档里。
点击红色区域进行条件设置，即可得到引物设计结果并显示该对引物的详细信息，
点击如下区域，可以得到多组结果，可自行进行比较后选择。
点击如下选项，可以详细看到目前锁定引物的信息，包括是否存在引物二聚体、发夹结构等。对于不满意的结果，可以通过适当改变条件来调整。
以上是通过软件进行引物设计的方法，在刚刚提到的NCBI网站里也是可以直接设计的，继续以人的IL-1b基因为例，步骤如下。
点击红色区域，得到如下界面后，进行条件设置，其中一定记得蓝色框格部分要选中这个选项。
点击Get Primers，即可得到引物设计结果。此时需要注意Tm值及GC含量是否合适，同时保证Self complementarity与Self 3' complementarity越小越好。
除了上述两种方法，小编还为大家推荐两个网站，分别是https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/
与https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/。第一个网站进行物种选择后，输入NCBI结果中的ENST编码即可得到结果。第二个网站目前只针对人与小鼠物种开放，输入基因ID后即可得到相应结果。如想获取详细的使用方法或对上述描述有疑问的小伙伴可以通过后台留言给我们哦~
以上就是舍为斯为大家呈现的引物设计相关详细步骤及原则，希望能够通过我们的努力，推出更多实用的文章为大家在实验的漫漫长途中排忧解难。
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