编者说 /
上篇我们向各位读者朋友介绍到了蛋白表达以及减少包涵体产生的方法，在实验过程中，要想尽可能多地获得可溶性蛋白，可以按照本文中提到的建议进行调整。一般收集到蛋白之后，就要进行纯化了，今天小编为大家分享关于蛋白纯化与包涵体复性的相关操作。
蛋白纯化
由于蛋白存在可溶与不溶两种不同的形式，所以纯化方式也有所不同。首先是可溶性蛋白的纯化，相对来说比较简单。以结合GST标签蛋白为例，在将菌体裂解充分后，离心获得上清溶液，将所获得的蛋白溶液过柱，这时用到的柱子可以特异性识别并结合GST标签。继而用缓冲液过柱，即可将没有GST标签的杂蛋白洗去，再用洗脱缓冲液将结合GST标签的化学键断开，收集洗脱液。
包涵体蛋白的纯化相对繁杂，因为需要经过洗涤、溶解、复性几个步骤[1]。蛋白包涵体是一个广泛存在的现象，在大肠杆菌中，包涵体可在细胞的两个位置出现：细胞质和外周胞质。通常认为蛋白的聚集无论出现在细胞内还是细胞外，都是由于中间体不能完成折叠导致的，它不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。由于包涵体中不仅含有重组蛋白，同时还含有少量的杂质，所以此时要通过加入浓度较低的变性剂或者去垢剂洗去膜蛋白、质粒等杂质。在溶解包涵体时，可选择加入较强的变性剂，来打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，当其中含有二硫键时，还要加入DTT等还原试剂。包涵体的复性指的是使蛋白恢复成正常折叠结构的过程，主要复性方法有透析、稀释、凝胶过滤层析与离子交换层析等，后续还需要对复性后的蛋白进行效率检测。因为包涵体复性是一个很耗时且复杂的过程，通常情况下，提供温和的条件和适当的复性缓冲液，将有超过40%的包涵体恢复生物活性和天然构象[2]。
包涵体复性 稀释复性操作简单，可以通过直接加入水或者缓冲液，但是这会造成后续样品体积较大，后续处理相对困难。透析复性是通过缓慢透析从而去除变性剂，使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。下面举例展示透析复性的操作步骤，大家可根据自己实验情况进行参考。 1. 如果二硫键参与了蛋白复性，在试剂溶解过程中加入5mM的DTT； 2. 在烧杯中准备1L 浓度为6M的尿素溶液； 3. 将所得的包涵体蛋白溶液转移到提前备好的透析盒中，用6M尿素透析6小时； 4. 每隔6-12小时向烧杯中加入250 mL的25mM的TrisHCl（pH 7.5）； 5. 一旦体积达到3L，用2L浓度为25mM的TrisHCl（pH 7.5）和150mM氯化钠更换透析溶液，再透析6个小时。为了保持蛋白质的稳定性，最好在4℃冰箱中进行透析； 6. 从透析盒中回收样本。通过离心法从样品中去除沉淀，测定蛋白质的活性。 超滤法可能会使蛋白在膜上聚集变性，易造成膜污染。与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。 关于蛋白的纯化与包涵体复性相关操作及优势就介绍到这里，后面小编会继续更新GST pulll down实验中后续诱饵蛋白捕获猎物蛋白的相关操作，还请大家持续关注。
