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     多细胞生物中，调节性细胞死亡过程 (RCD) 是细胞维持组织形态和功能必不可少的稳态机制。此前研究较多的调节性细胞死亡包括三大类：细胞凋亡、自噬和坏死。
    

    “铁死亡”这一概念最早在 2012 年由 Dr. Brent R Stockwell 提出，它是一种铁离子依赖的新型细胞调节性死亡，在细胞形态学上，生化特征区别于细胞凋亡、坏死、自噬。从机制上简单来说，铁死亡是细胞膜上铁依赖性的高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，诱导的细胞死亡。

调节性细胞死亡的特征

      铁死亡不仅与众多疾病的发生发展有关，其相关信号通路上的关键蛋白也可成为药物的作用靶点。近年来，以铁死亡为研究对象的高分文章不断涌现，而且近几年国家自然科学基金的资助项目中，铁死亡相关项目的比例呈指数增长。说明铁死亡已成为当前生命科学/基础医学研究的一大热点。

铁死亡的调控机制

      关于铁死亡的调控，主要受谷胱甘肽 (GSH) /谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4) 途径的调节；铁代谢以及脂质代谢的相关通路也发挥着重要作用。

lGSH/GPX4 途径

GPX4 相关信号通路^[1]

      胱氨酸/谷氨酸反向转运体 (System Xc-) 是一种广泛分布在磷脂双分子层中的重要的抗氧化体系，由两个亚基 SLC7A11 和 SLC3A2 组成的异二聚体。胱氨酸和谷氨酸通过 Xc-系统以 1:1 的比例进出细胞交换，被吸收的胱氨酸(Cystine) 在细胞中被还原为半胱氨酸 (Cysteine)，并参与 GSH 的合成。     

     GPX4 是催化哺乳动物细胞中磷脂氢过氧化物 (PLOOH) 还原的主要酶。GPX4 将GSH转化为氧化型谷胱甘肽 (GSSG)，并将细胞毒性脂质过氧化物 (PL-OOH) 还原为相应的醇 (PL-OH)。因此，GPX4 活性的抑制可导致脂质过氧化物的积累。GPX4 表达下调的细胞对铁死亡更敏感，而 GPX4 表达上调则抑制铁死亡。GSH 在谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 的作用下减少 ROS 和活性氮。此外，甲羟戊酸 (MVA) 途径通过调节硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟来影响 GPX4 的合成，从而调节铁死亡的发生。

l脂质过氧化与铁的积累

脂代谢与铁死亡相关通路^[2]

      铁依赖性脂质 ROS 积累与所有途径的铁死亡有关。不受限制的脂质过氧化是铁死亡的标志。

      游离多不饱和脂肪酸是合成脂质信号转导介质的底物，但它们必须被酯化成膜磷脂并被氧化才能传递铁死亡信号。脂氧合酶 (LOX) 和细胞色素 P450 氧化还原酶 (POR) 通过脂质的双氧合启动脂质过氧化。研究表明，磷脂酰乙醇胺是诱导细胞铁死亡的关键磷脂。酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3 (LPCAT3) 参与磷脂酰乙醇胺的生物合成和重构，激活多不饱和脂肪酸并影响其跨膜特性。因此，降低 ACSL4 和 LPCAT3 的表达可减少细胞内脂质过氧化物底物的积累，从而抑制铁死亡。

      铁积累 (如增加铁吸收、减少铁储存和限制铁外流)可以促进铁死亡。过量的铁通过至少两种机制促进随后的脂质过氧化：通过铁依赖性 Fenton 反应产生活性氧 (ROS) 以及激活含铁酶。

铁死亡的分子调控

      依据铁死亡的发生机制，研究者们开发出了种类多样的铁死亡诱导剂小分子与铁死亡抑制剂小分子。这些分子靶向了铁死亡进程中的不同通路，具体可分为以下几种：

铁死亡在疾病中的功能

铁死亡跨学科领域的相关领域流^[3]

      细胞铁死亡被发现与很多疾病的发生都有密切的关系，具有很大的药物开发潜力。目前主要应用铁死亡的方式包含通过抑制铁死亡来使细胞免于进入病理状态，或者通过诱导特定目标的铁死亡来清除病变的细胞。

      铁死亡与神经退行性疾病密切相关。帕金森疾病中细胞铁含量会大幅上升，这会加速α-突触核蛋白原纤维的形成，导致疾病的发生。有研究证实可以通过加入铁螯合剂deferiprone（DFP）来保护帕金森疾病的早期患者。之后也有研究证实铁死亡是多巴胺使神经元发生变形死亡的主要方式，这一过程是通过kinase C实现的。在另一种神经退行性疾病阿尔茨海默症（AD）中GPX4蛋白也是一个极其关键的靶点蛋白。研究发现敲除小鼠内的GPX4蛋白后，小鼠表现出了神经功能缺失和认知障碍等典型的阿兹海默症症状，同时用铁死亡抑制剂可以一定程度上缓解小鼠阿兹海默症的严重程度。这些例子都说明铁死亡在神经退行性疾病中的重要作用。

      铁死亡还被发现与一些组织损伤疾病具有一定的联系。有研究发现在阿霉素处理和缺血再灌注过程中心肌细胞的死亡形态变化与铁死亡高度一致。后续的研究证实阿霉素处理后细胞内的血红酶素氧化酶HMOX1表达量上调，导致细胞内的铁离子浓度升高，进而诱导细胞的铁死亡。此外很多研究发现在药物处理或缺血倒灌引起的肝脏或肾脏急性损伤都存在着细胞铁死亡的现象，使用相应的铁死亡抑制剂可以有效地缓解这些过程。

      铁死亡也被发现是一种有效的清除癌细胞的手段。研究发现黑色素瘤中的脱分化细胞对铁死亡非常敏感，将抗黑色素瘤药物和铁死亡诱导剂联用可以更好地清除黑色素瘤。p53作为一个常见的癌症细胞突变基因会抑制细胞内xCT基因的表达同时激活细胞内脂质氧化酶ALOX12的表达。因此在p53突变的癌细胞内加入脂质过氧化的诱导小分子可以诱发该癌细胞发生铁死亡，达到清除该细胞的目的。同时很多研究发现很多内源的抑癌因子也是通过调控铁死亡相关的通路来抑制癌症细胞的转化的，如MLL4, BAP1和NFS1。此外还有研究显示促进癌细胞摄入外界环境中的多不饱和脂肪酸（PUFA）可以抑制癌症细胞的增长。实验发现饮食富含多不饱和脂肪酸的小鼠体内癌症细胞生长的速度要远远小于饮食多为单不饱和脂肪酸的小鼠。与之相反的是胆固醇类物质则会促进癌症细胞的生长。

铁死亡的检测方法

l铁死亡的关键指标

      铁死亡是由铁依赖的脂质过氧化驱动的，因此在铁死亡期间检测这种脂质过氧化是必要的。线粒体在铁死亡期间通常表现出萎缩、致密的形态（因此可以通过检测线粒体来判断铁死亡)。

铁死亡相关蛋白表达

     qRT-PCR/WB检测与铁死亡相关的蛋白表达，如PTGS2、NOX1、FTH1、COX2、GPX4、ACSL4等，其中COX2、ACSL4、PTGS2、NOX1在铁死亡细胞中表达上调，GPX4.FTH1在铁死亡细胞中表达下调。

l最常见的细胞表型检测

      铁死亡会导致细胞死亡。因此一般在铁死亡的研究中，检测细胞活力是常见方法，同时也会通过染色等方法来观察细胞膜通透性，线粒体形态等,若细胞线粒体碎裂、空泡化和嵴增大都表明细胞发生了铁死亡。  

抑制 FXN 对 Erastin 诱导的 HT-1080 细胞铁死亡的影响[4]

A, 细胞暴露于不同浓度的 Erastin，检测细胞活力；

B, Erastin 处理细胞 12 小时后用荧光显微镜观察 PI 阳性细胞；

l亚铁离子的检测

      细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一，亚铁离子积累可以特异性地增加氧化应激水平。例如，通过用 FerroOrange 染色细胞 (亚铁离子探针)，结果表明 NaIO3 和 Erastin 处理的细胞积累了过多的亚铁离子，说明诱导了铁死亡^[5]。

通过 FerroOrange 染色评估亚铁离子水平

lROS检测：

     ROS 和脂质 ROS 在铁死亡中起关键作用，增加的超氧化物歧化酶 (SOD) 可抑制体内的 ROS 水平。细胞内会由于铁的积累而抑制抗氧化系统，铁可能直接通过 Fenton 反应产生过量的 ROS，从而增加氧化损伤。

CPS 有效抑制 RAW 264.7 细胞的铁死亡[6]

A-B, 在有无 CPS 条件下 Erastin 对 ROS 水平的影响；

C-D, 在有无 CPS 或 DFO 条件下Erastin 对细胞活力的影响

l脂质过氧化

      除了 ROS 检测，铁死亡的脂质过氧化的指标还有谷胱甘肽 (GSH) 合成的变化、脂质过氧化物 (MDA, LPO) 水平的变化。

铁死亡抑制剂 Fer-1 可减轻 HH （一种铁超负荷疾病）小鼠中铁过载引起的肝损伤[7]

用或不用 Fer-1 治疗的野生型、Hjv–/–、Smad4Flox/flox 和 Smad4Alb/Alb 小鼠中, A, 肝脏 MDA 含量；B, 肝脏 Ptgs2 mRNA 水平；C, 肝脏 NADPH 含量；D, 血清 ALT 水平

      有研究发现，用 RNA 干扰抑制 DJ-1 表达可以与 Erastin 协同抑制细胞内 GSH 水平 (图A)。同时，添加外源性 GSH 或 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 可以逆转 Erastin 诱导的脂质 ROS 积累 (图B) 和细胞死亡 (图C)。因此，作者推测 DJ-1 可能会影响 GSH 的合成从而抑制铁死亡^[8]。

 DJ-1 通过抑制 GSH 水平负调节铁死亡

A, Erastin 处理DJ-1 KD H1299 细胞 6 h 后 GSH 水平；

B, 在有无 GSH 或 NAC 条件下细胞用 Erastin 处理细胞 12 h 后脂质 ROS 水平；

C, 用Erastin 处理细胞 36 h 后，测定细胞活力

      铁死亡受细胞内信号通路的严密调节，既包括铁稳态的调节通路,更有铁代谢以及脂质代谢相关通路等。但是各个通路相辅相成，互相影响。调控途径不同，检测的指标也十分多样化，天津舍为斯生物可以提供铁死亡相关实验服务，欢迎咨询~

参考文献：

1.Jiang X, et, al. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Apr;22(4):266-282.

2.Chen X, Kroemer G, Tang D, et, al. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 May;18(5):280-296.  

3.Jiang X, Stockwell BR, Conrad M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Apr;22(4):266-282.

4.Du J, Zhou Y, Li Y, Tong X, Wang Y, et, al. Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis. Redox Biol. 2020 May;32:101483.

5.Tang Z, Ju Y, Dai X, Zhang J, Gu P ,et, al. HO-1-mediated ferroptosis as a target for protection against retinal pigment epithelium degeneration. Redox Biol. 2021 Jul;43:101971.  

6.Wang H, et, al. Characterization of ferroptosis in murine models of hemochromatosis. Hepatology. 2017 Aug;66(2):449-465.

7.Li L, et, al. Polystyrene Nanoparticles Reduced ROS and Inhibited Ferroptosis by Triggering Lysosome Stress and TFEB Nucleus Translocation in a Size-Dependent Manner. Nano Lett. 2019 Nov 13;19(11):7781-7792.

8.Cao J, et, al. DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase. Nat Commun. 2020 Mar 6;11(1):1251.

【END】