一、什么是载体？
1、把一个目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），主要目的是分离、纯化及表达特定的基因，此过程中需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（Vector）。
2、基因工程上所用的载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制功能，可用以置换或插入外源（目的）DNA而将目的DNA带入受体细胞进行表达，主要包括质粒、噬菌体、病毒等。
二、载体的分类
1、载体按属性可以分为：
（1）病毒载体，常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞；
（2）非病毒载体，一般是指质粒DNA；
2、按进入受体细胞的类型可以分为：
（1）原核载体
（2）真核载体
（3）穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。
3、如果按功能分类，可以分为：
（1）克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS 等），可以携带DNA 片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA 片段（外源基因）的载体；
（2）表达载体：这种载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA 序列）有关的元件即成为表达载体。
4、按性质分：
（1）融合型载体
（2）非融合型载体
三、什么是质粒？
质粒是在细菌和其他细胞中发现的一种小型、环状DNA 分子。与细菌染色体分开并独立复制；通常只携带少量基因，特别是一些与抗生素耐药性有关的基因；可以在不同的细菌细胞之间传递。
1、质粒发现历程
虽然质粒已经成为生物学实验的基本工具，但是不得不提，质粒的发现也经历了一个曲折的过程，分享给大家。
十九世纪四十年代，科学家们发现一种可以在细胞之间互相转移的细胞质遗传因子，并提出了多种猜测，包括寄生虫、共生体、基因等。但命名始终未得到最终的确认。
直到1952 年，Joshua Lederberg 开始着手阐明这些细胞质遗传因子的分类，并首次提出了“plasmid”这个名称。“plasmid”是“cytoplasm” 和“id” (拉丁语中的‘it’)的整合体，并将其作为“任何染色体外遗传决定因子”的通用术语。然而，Joshua Lederberg的定义石沉大海。几年后，Élie Jacob 和 François Wollman 提出了一个单独的术语“episome”，定义为“可以自主存在或整合到染色体中的非必需遗传元素”，并成为这些元素的广泛采用的名称。值得一提的是，Ester Lederberg在 1952年发现Fertility/F因子可以在某些情况下整合到大肠杆菌染色体中，辅证了该名称的合理性。
1960年代，转折点再次出现。科学家们发现Resistance/R因子可以在细菌之间转移，然而与F因子不同，R因子并不能整合到染色体中。从此，“plasmid”代替“episome”重新步入了历史舞台。
十九世纪七十年代，限制性内切酶、DNA 连接酶和凝胶电泳技术的发展使得DNA片段的转移成为可能。DNA片段与质粒或载体 DNA 骨架的组合产生重组DNA分子，为基因功能的研究提供了新手段。
2、质粒的基本特征
质粒的自主复制性（可扩增性）：质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，并根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1~3拷贝；松弛型复制控制的质粒 10~60拷贝，不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。
质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
接合型质粒——能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等。
非接合型质粒——不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。
携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物等。
物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
3、质粒元件解析
Origin of Replication (ORI) 复制起始位点：通过募集复制相关蛋白在质粒内启动复制。
Antibiotic Resistance Gene 抗生素抗性基因：筛选含有质粒的细菌，例如：Ampicillin，Kanamycin。质粒含有抗生素抗性基因，而没有质粒 DNA 的细菌将无法在含有抗生素的LB培养板中存活。
Multiple Cloning Site (MCS) 多克隆位点：包含数个限制性酶切位点，可通过限制性酶消化和连接轻松插入目的DNA。在表达质粒中，MCS 通常位于启动子的下游，因此当基因插入 MCS 时，其表达将由启动子驱动。一般而言，MCS 中的限制性位点是独一无二的，并不位于质粒骨架的其他位置。因此，酶切时并不会破坏质粒载体其他部位的结构。
Insert 插入片段：插入片段是克隆到 MCS 中的基因、启动子或其他 DNA 片段，通常是人们所希望研究的遗传元件。
Promoter Region 启动子：驱动目标基因的转录。启动子的选择需要与质粒表达的物种相匹配。例如：如果打算在人细胞中使用质粒，则启动子将是人或哺乳动物启动子序列。而在大肠杆菌中使用质粒，则将是原核生物启动子序列。选择组织特异性启动子，则可以实现目的基因的组织特异性表达。启动子的强度与目的基因的表达水平密切相关。
Selectable Marker 选择性标记：筛选已经成功摄取质粒的细胞。注意该选择性标记区别于细菌中的抗性筛选。细菌抗性基因筛选用于质粒扩增过程，选择性标记用于筛选或标记转染后的细胞。选择性标记通常是抗性筛选或者荧光蛋白。
Primer Binding Site 引物结合位点：短的单链 DNA 序列，用作 PCR 扩增或测序的起始，验证质粒序列。
注：大多数质粒图谱中都会有箭头，箭头的方向有两种解释：一种是复制起始位点的方向，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。另一种是转录方向，转录方向主要是由启动子开始的一个箭头，是启动子序列的顺序。其中最重要的就是要弄清楚目启动子的方向。
4、质粒的分类和用途
Cloning Plasmids 克隆质粒：用于促进 DNA 片段的克隆。克隆载体往往非常简单，通常只包含细菌抗性基因、复制起点和 MCS。
Expression Plasmids 表达质粒：用于基因表达（基因功能的研究）。表达载体必须包含启动子、转录终止子序列和插入基因。启动子驱动插入DNA 转录生成RNA，合成的RNA上的终止子序列发出停止转录过程的信号。表达载体可以通过增强子序列增加蛋白质或RNA的产量。表达载体可以在各种细胞类型（哺乳动物、酵母、细菌等）中驱动表达，这在很大程度上取决于用于启动转录的启动子。
Gene Knock-Down Plasmids 基因敲减质粒：用于减少内源基因的表达。通过表达靶向目的基因 mRNA的shRNA来实现。这些质粒具有可以驱动短 RNA 表达的启动子。
Genome Engineering Plasmids 基因工程质粒：用于靶向和编辑基因组。通常使用 CRISPR 技术完成。
Reporter Plasmids 报告质粒：用于研究遗传元件的功能。这些质粒包含一个报告基因（例如，荧光素酶或GFP），可提供遗传元件活性的读数。
Viral Plasmids 病毒质粒：通过修饰的病毒基因组，有效地将遗传物质递送到靶细胞中。可以使用这些质粒来制造病毒颗粒，例如慢病毒、逆转录病毒、AAV 或腺病毒颗粒，从而高效感染靶细胞。
如何读懂一个质粒：
1. 首先看复制起点Ori。了解质粒是原核质粒/真核质粒/穿梭质粒。原核生物复制起始点只有一个，真核生物DNA复制起始点有多个。上图中pEGFP-N2是一个穿梭质粒，穿梭质粒是指可以在多种宿主下复制。
2. 看抗性。有很多抗性基因，会在后边加上r，抗性便于后期筛选，比如氨苄(Amp)，四环素(Tet)等。上图中抗性为Neor/kanr两个抗性,Neor是真核抗性，Kanr是原核抗性，所以pEGFP-N2可以在大肠杆菌和酵母真菌中用不同的抗性药物筛选。看清楚抗性，才能不用错，否则是长不出克隆的。
Ampr 表达β－内酰胺酶，水解β－内酰胺，解除氨苄的毒性；tetr 合成出的蛋白质会阻碍四环素生效；neor（kanr）表达氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活。
3. 看多克隆酶切位点MCS。我们目的片段就是要插入这些多克隆酶切位点中间。它具有多种限制内切酶的单一切点（质粒上只能有该内切酶的唯一酶切序列，不然质粒被切成多段了），便于咱们要研究的基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选，最常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统。
4. 看是否含有表达系统原件，即启动子（promoter）－核糖体结合位点（RBS）－转录终止信号（AATAAA同时是poly A）。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。常见的启动子有：CMV、EF1（这俩是启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），35S、2×35S（植物）。
5. 看报告基因：例如β-半乳糖苷酶、EGFP、luciferase等，便于迅速检查功能基因是否表达的阳性判断，表达成功的蛋白在小鼠体内分布位置，直接看EGFP、luciferase的荧光就ok。
6. 看引物结合区（primer）：一般位于多克隆位点区的上、下游，便于通用引物的PCR验证、测序验证之用。
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