质粒的复制起点——ORI
复制起点（replicon）是使用质粒时必须要考虑的一个基本元件，它显著影响着质粒拷贝数，一种复制起点不一定能在所有生物体中行使其功能，使用质粒时需要对复制起点进行选择。
1、复制起点
复制起点由起始复制子（ORI）及其调控元件组成。ORI是DNA复制起始的位点，当细胞中质粒的存在成为生存所必需时，ORI 可加强质粒的复制，比如质粒上含有抗性基因，而环境中存在其对应的抗生素时质粒的拷贝数会增加。
质粒的复制起点通常与存在于宿主染色体中的不同，但是质粒复制也依赖于宿主中的机制。ORI序列通常富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T），A-T碱基对是由两个氢键连接，而C-G是由三个氢键连接，因此，富含A-T的DNA序列更易解链，解链的ORI区域给复制机器提供了结合的空间从而起始质粒复制。
ORI 的数量众多，由于我们一般常在细菌中使用质粒，所以科学家目前对细菌中发现的复制子更为关注，而对真核细胞和病毒中的关注较少。常见的复制子有ColE1，pMB1，pSC101，R6K和15A，复制起点的不同可能导致质粒拷贝数的不同。
通常，复制起点的控制可分为松弛型（relaxed）和严紧型（stringent）两种。质粒的拷贝数与正调控与负调控的相对强度相关，也可通过对复制子进行突变而改变。例如，pMB1的起始复制子可维持细胞中含有大约20个质粒拷贝，而pUC却能在每个细胞中产生多达700个质粒拷贝。
严紧型质粒：当细胞复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞中只有1-2个质粒，质粒的复制与染色体的复制表现出受相同因素控制，染色体不复制时，质粒也不复制，如F因子。
松弛型质粒：为小分子量质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，用药物抑制了染色体复制后它们仍能复制，表现出受到与染色体复制不同的因素控制，每个细胞中一般含有几十至上百个左右质粒。
另外，质粒复制的类型还与其存在的细胞相关，如有些R因子在大肠杆菌中复制是严紧型，而在变形杆菌中是松弛型。猜测影响质粒复制控制类型的因素除了质粒的内在因素ORI，其宿主细胞内还存在其它外在因素。
02如何选择合适的ORI
ORI的选择取决于我们需要的质粒拷贝数，打算在哪种宿主中使用以及是否需要考虑多个不同质粒的相容性。一般来讲，含有相同ORI的质粒是不相容的，因为它们会竞争同一种复制机制，导致不稳定且不可预测的胞内环境。来自不同菌株的的质粒不可以共转化，所以实验中如果需要两个质粒，一定要确保它们的ORI相容。
下表中列出了常用的克隆载体、它们的拷贝数、ORI及相容性。A、B、C组各指一种不相容组，同组的质粒不相容，不能共转化。如pUC与pBR322不相容，而pUC和pR6K相容。
pir基因：表达PI蛋白，该蛋白具有DNA聚合酶活性，与复制子R6K结合启动复制。
F1复制子：不同于细菌的复制子，可在质粒中启动单链DNA（ssDNA）复制（正义链，即编码链，与mRNA序列相同的那条DNA链），质粒拷贝数主要还是受另一个双链复制子控制
一个质粒上也可以含有两个复制起点，如在人工构建的穿梭质粒，为了使质粒可以在不同类群宿主中存活和复制，科学家在质粒中构建了两种不同的复制起点和选择标记。
下图为一个穿梭载体pKOR1，是一个可以在革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌中都可以启动质粒复制的载体。
ori（-）：ColE1质粒复制子区域，repF：pE194ts的复制子，为金黄色葡萄球菌中的一种温敏质粒复制子，其中（+）表示革兰氏阳性菌，（-）表示革兰氏阴性菌
3、影响质粒拷贝数的其它因素
虽然复制起点很大程度上决定了质粒拷贝数，还有一些其它外部因素也需要我们知道。掌握这些因素的影响可以帮助我们有计划的获得质粒。
插入片段：如果质粒中含有很大片段的插入或质粒会表达有毒产物，细菌中只能保持较低的拷贝数。
大肠杆菌菌株：虽然大多数大肠杆菌菌株可以用于繁殖质粒，但是end-A 菌株是高产量质粒的最佳选择。
生长环境：氧气浓度、温度、培养液体积、抗生素和培养基都会影响质粒拷贝数。一些ORI是温敏的，还有一些质粒可以使用氯霉素（Chloramphenicol）骗取其复制出更多的拷贝数，一定要确保生长环境不会与质粒的复制相抗。
培养基：新划线产生的菌落含有更高的拷贝数，为了提取质粒而过夜摇菌时，相比使用冻存菌或者先前摇起来的菌液，选择挑取单克隆的效果更好。摇菌时培养12-16个小时能获得更高的拷贝数，因为此时细菌刚生长繁殖到达平台期，但细菌还没有开始死亡。
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