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因为AAV转染细胞的表达效率低，在没有辅助病毒或辅助因子的情况下，单链DNA变成双链DNA的过程十分缓慢；另外，体外细胞生长速度快，细胞中感染的AAV会随着细胞分裂不断稀释，进一步导致其表达水平降低。但在体内研究中，可以利用不同血清型的AAV，特异性靶向神经系统、眼睛、肌肉和肝脏等多种不同类型的器官组织，且转导途径简便，可以将纯化浓缩好的病毒直接多点注射靶器官，注射的组织细胞通常增殖不会很快，其免疫原性也低于腺病毒，感染效率高于慢病毒，所携带的外源基因表达的因子较为丰富，因此表达丰度和持续的时间更好。

① 血清型的选择：AAV的血清型主要由AAV衣壳蛋白的结构所决定，不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表面受体，因此血清型的选择会影响AAV的感染效率、组织亲和性、和开始表达的时间。

②启动子的选择：是选择广谱性启动子还是特异性启动子。相比于血清型的组织特异性，特异性启动子可实现细胞的特异性，因此对特异性要求较高的研究，可以选择某种细胞特异性表达的启动子。

根据启动子的表达特征，可将启动子分为：

1）组成型启动子：一般来自于看家基因，可连续不断地启动基因的表达。

2）诱导型启动子：只有在一定的外界诱导或刺激作用下才能启动基因的表达。

3）器官（或组织）特异性启动子：只有在特定的器官（或组织）中才能启动基因的表达。

组织特异性启动子只在特定的器官（或组织）中才能启动基因的表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果。

③注射方式：对于可以进行局部注射的组织器官，采用局部多点注射靶器官可取得较好的特异性和表达效果，病毒的注射方式会影响其感染效率，常见的注射方式有：尾静脉注射、腹腔注射、灌肠、脑定位立体注射、原位注射等。

常见的部位注射方式可参考下表：

④病毒量及滴度：根据不同的靶器官组织和所使用的不同AAV血清型（扩散能力不同），推荐注射的AAV量不同，传递到组织中的病毒颗粒数量对于感染效果影响很大。但AAV使用量并不是越多越好，过多的量可能出现病毒溢出，而且根据我们的经验，病毒量太多有时候甚至会出现表达降低的情况。

⑤检测时间：不同基因的表达高峰时间是不同的，再加上AAV需要从单链DNA变成双链DNA，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上。

AAV在细胞内主要是以环状的dsDNA附加体（Circularised dsDNA episomes）的形式存在，而不会像慢病毒那样整合到宿主细胞的基因组。对于分裂不旺盛的细胞，如神经元，AAV可持续表达1年以上甚至2年，对于分裂较旺盛的细胞，一般也可维持3~6个月或以上。

①基因过表达：将目的基因的CDS区构建到AAV载体，注射到动物体内实现过表达；

②基因干扰表达：将针对目的基因设计的shRNA构建到AAV载体，注射到动物体内实现干扰表达；

③目的基因敲除：将针对目的基因设计的sgRNA和Cas9编码序列分别构建到AAV载体中，注射到动物体内实现基因敲除。

④内源过表达：将针对目的基因设计的sgRNA和dCas9分别构建到AAV载体，实现内源过表达。

如果是用于体外感染细胞的病毒，一般不用纯化，但对于用于注射至体内的病毒，无论是慢病毒、腺病毒还是AAV，均有必要进行纯化。这是由于病毒在包装生产过程中，未经纯化的病毒液含有大量的病毒外壳、细胞（293T）内毒素、破损颗粒、及细胞碎片等，这些物质如果随病毒一起注射到动物体内，可能会引发强烈的免疫反应，从而影响动物的生存状态。另外病毒纯化也是一个浓缩的过程，有利于后续的稀释使用。