细胞ROS水平常用检测试剂及方法_新闻中心_舍为斯生物-推动生物医学快速发展

ROS水平的变化常被用作监测细胞铁死亡水平的指标。因此，针对不同的铁死亡效应，可采取多种ROS检测手段。

细胞内的ROS可以通过荧光成像或流式细胞术使用荧光探针DCFH-DA，脂质ROS可通过C11-BODIPY等检测。ROS的荧光强度与铁死亡呈正相关。下面给大家分享两种探针的具体使用方法。

DCFH-DA使用方法

1、装载探针

对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

①使用DCFH-DA探针需要避光吗？是否需要使用透膜剂？

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。因此需要避光，但不需要使用透膜剂。

②为何有时染色后背景颜色过深，如何消除这种现象？

染色前需要将细胞培养基去除后，使用PBS清洗2-3次，尽可能去除培养基中的血清。染色时注意时间不能过长，颜色会随着染色时间的增加而增加。

2、检测

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。

3、参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

4、其它说明

阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。

脂质ROS检测

由铁死亡引起的细胞死亡的一大特征是细胞膜中脂质发生过氧化反应，通常表现为脂质过氧化物的积累和脂质ROS水平的上调，而不同于常规ROS探针，C11 BODIPY 581/591常被使用来特异性的侦测脂质中ROS水平变化。

C11 BODIPY 581/591是一种BODIPY（氟硼荧）衍生物，一种脂质过氧化的荧光探针，其结构为BODIPY的α不对称取代，一端为丁二烯苯基，与母体形成一个大共轭结构，使此侧的原子处于同一个平面；另一端为C11(十一酸)。独特的化学结构让C11 BODIPY 581/591具有良好的光稳定性、荧光伪影很低、并能轻松进入细胞膜。在细胞膜内，C11 BODIPY 581/591的丁二烯部位与ROS(活性氧)发生氧化还原反应，其充当还原剂作用，发射波长由591nm(还原型)红移至510nm（氧化型），激发波长分别为581nm(还原型)、500nm(氧化型)。无论是氧化型，还是还原型，其主体骨架保持不变，均具有良好的亲脂性，均不会自发离开细胞膜磷脂双分子层，还原态和氧化态处在磷脂双分子层的两个不同区域，离双分子层中心距离为18Å和<7.5Å的位置。

C11 BODIPY 581/591 还原态和氧化态发射波光谱能很好分开，具有高量子产量，低浓度标记即可，对氧自由基、过氧亚硝酸盐比较敏感，对超氧化物、NO、铁离子、H2O2不敏感。常用于评价活细胞内脂质过氧化和抗氧化性能的研究。

染色步骤

1.细胞铺板，37℃孵育过夜；

2.用待研究药物处理细胞；

3.加入一定量的 10mM C11 BODIPY 581/591 储存液使其终浓度为 10μM。（或开始做实验做下浓度优化，测定几个浓度梯度）。37℃孵育 30min。

4.吸走培养基，用 PBS 清洗三次；

5.荧光显微镜测定荧光。还原态染料用 Ex/Em=581/591nm（Texas Red 滤片）；氧化态染料用Ex/Em=488/510nm（FITC 滤片）来测定。

6.590m/510nm 发射光下测定的荧光读数比值反映细胞脂质过氧化水平。

图像处理和分析

分别使用传统的 Texas Red(590nm)和 FITC（510nm）发射滤片来进行荧光成像。

通过定量荧光强度和计算分别在 Texas Red(590nm)和 FITC（510nm）通道下测定荧光的比值来反映过氧化水平。

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