细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命，最后裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬的过程，也称为程序性细胞死亡。
细胞凋亡检测有很多种方法，常见的有Caspase活性检测、Annexin V检测、线粒体膜电位检测、TUNEL检测等。细胞发生凋亡时，不同时期在不同区域（如细胞膜、细胞浆、线粒体、细胞核等）会发生不同的生理生化改变。因此，针对不同时期的细胞凋亡检测要采用不同的方法。
今天，我们主要和大家介绍一下JC-1法检测细胞凋亡的原理、实验步骤、注意事项、以及常见问题与解答。
JC-1检测
原理：
线粒体膜电位 (Mitochondrial membrane potential, △Ψm) 是指线粒体内膜两侧质子分布不均一而形成的电化学梯度。线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件。
JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体存在，红色荧光强，细胞凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体存在细胞质，绿色荧光增强。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。
JC-1实验原理
实验步骤：
1、JC-1染色工作液的配制：
六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50-100万细胞需0.5ml JC-1染色工作液。取适量JC-1，并用超纯水稀释。剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加JC-1染色缓冲液，混匀后即为JC-1染色工作液。
2、阳性对照的设置：
把CCCP按比例加入到细胞培养液中，处理细胞20分钟。随后装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10μM CCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。
对于悬浮细胞：
（1）取10-60万细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
（2）加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。
（3）在孵育期间，配制适量的JC-1染色缓冲液，并放置于冰浴。
（4）37℃孵育结束后， 600g，4℃，离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
（5）用JC-1染色缓冲液洗涤2次：加入1ml JC-1染色缓冲液重悬细胞，600g，4℃，离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1ml JC-1染色缓冲液重悬细胞，600g，4℃，离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。
（6）再用适量JC-1染色缓冲液重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
结果分析：
检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。
用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，绿色荧光通过FL-1通道检测，红色荧光通过FL-2通道检测。FL-1+，FL-2+为正常细胞，FL-1+，FL-2-为凋亡细胞。
JC-1染色结果
注意事项：
1. JC-1在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
2. 必须先把JC-1用超纯水充分溶解混匀后，才可以加入JC-1染色缓冲液。否则，JC-1会很难充分溶解，会严重影响后续的检测。
3. 装载完JC-1后用JC-1染色缓冲液洗涤时，使JC-1染色缓冲液保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。
4. JC-1探针装载完并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
5. CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。
6. PH的变化影响膜电位，保持平衡染液中PH的一致性。
7.注意补偿的调节，可以用补偿微球或者对应的FITC/PE染料抗体进行调节。
线粒体膜电位检测（左图膜电位正常为多聚体，细胞正常；中图出现膜电位开始降低，出现单体，有凋亡细胞；右图膜电位都降低了，JC-1以单体存在，都为凋亡细胞）
常见问题与解答：
1、组织样本可不可以用JC-1检测凋亡？
可以，但无法直接检测组织，可先将组织制备成单细胞悬液，再按照悬浮细胞的操作步骤来检测，另外需注意制备单细胞悬液的过程易对细胞造成损伤，需对制备方案进行摸索，避免因消化细胞引起线粒体膜电位变化而导致假阳性；也可提取组织中的线粒体（，再孵育JC-1，用荧光酶标仪检测实验结果。
2、贴壁细胞能否直接用JC-1在6孔板染色后，再用胰酶消化下来上流式？
不建议，贴壁细胞之间相互接触可能会导致细胞与染料接触不均一，对JC-1染料进入细胞造成影响，尤其是当细胞生长较为密集的时候。推荐消化细胞后再孵育JC-1。
3、石蜡切片和冰冻切片可以做JC-1吗？
不可以，JC-1实验的样本必须是活细胞。
4、JC-1孵育完成后不能及时检测，可以固定后再检测吗？
不可以，JC-1用于活细胞样本的检测，固定后细胞死亡；此外，染色后放置过久会导致荧光淬灭，建议染色30 min内完成检测。
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