细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间，细胞周期也是评价细胞增殖功能的重要实验。流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法，然而我们会碰到细胞量不够、细胞碎片太多等原因，导致实验一次次重复，本文就一起看看如何把细胞周期的数据变的更加漂亮，准确！
一、细胞周期简介
主要分为以下2大过程：
1. 分裂间期：间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）；
2. 分裂期M期：细胞分裂期，指细胞分裂开始到结束。
· 注：G0期是指某些细胞在分裂结束后会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂；但在一定适宜刺激下，又可进入周期；
· 因为分裂间期持续的时间远远比分裂期持续时间长，在一个正常细胞周期中，分裂间期时间会占整个细胞周期的90%～95%；
· 不同类型细胞的G1期时间长短不同，所以其细胞周期时间存在差异。如：人类胃上皮细胞为24小时，骨髓细胞为18小时，HeLa细胞为21小时。
二、常用的实验方法
流式检测法因适用于大量样品检测，可快速分析单个细胞的多种特性，是目前最为常用的测定细胞周期的一种方法，下面就详细介绍如何利用流式细胞仪进行周期分析。
1. 流式检测的实验原理
由于细胞周期各时相的DNA含量不同，因此，可通过特异性与DNA结合染料来检测细胞内的DNA含量来测定细胞周期。PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
2. 流式细胞仪的实验步骤
细胞样品的准备
1. 细胞培养:六孔板种下细胞，每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液（三复孔）,处理相应时间后，收细胞检测(单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106)
2. 细胞处理：胰酶消化含血清培养基中和，2000 rpm 5 min，用预冷PBS重悬洗涤，小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;
3. 细胞固定：1ml PBS充分重悬，成单细胞，轻轻边vortex，边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇，至终浓度75%，4度静置过夜（18-24h），-20度长期保存一个月（预约流式细胞仪）
4. 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次，2000rpm 5min去除 PBS 后加入200 ul PBS(约400ul)，为减少细胞损失可用1.5ml离心。移至1.5ml EP管中, 轻轻弹击离心管底，以适当分散细胞，避免细胞成团。
5. 加入20 μLRNase（储存浓度25 mg/mL，PBS 稀释成1mg/ml，工作浓度50ug/ml），重悬细胞，37 ℃水浴消化 30 min；
6. 加入PI 20ul至终浓度50ug/ml（储存液浓度25mg/ml, PBS稀释1mg/ml加入10ul）锡箔纸包住，避光4度染色30min，24h内上机检测。
7. 充分混匀细胞，便可利用流失细胞仪进行细胞周期
8. 数据的收集和分析
流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
Tips:
· 由于流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中需充分混悬细胞；
· 细胞固定后，不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片。
· 细胞可以长期保管在-20℃，可存放1个月，染色不会受影响；
· 用PBS重悬细胞时，动作要轻柔。
Tips:
· 上机检测时，必须重悬成细胞悬液后再检测，否则容易堵仪器管道；
· 如果细胞过多或聚团严重，可先用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，然后再上机检测。
3. 实验数据分析
常用的流式检测法分析细胞周期的方法是根据细胞DNA含量（横坐标）结合纵坐标的细胞数量来分析的，如下的乳腺癌细胞系T47D细胞周期分布图：
乳腺癌细胞系MCF-7细胞周期分布图
图形区（左侧）
1. G0/G1期：流式检测结果图的第一个峰；G1期是DNA含量最少的时期，DNA复制还没有开始；G0期是细胞静止期，不复制DNA，无法与G1期分开，所以报告为G0/G1期；
2. S期：在流式结果图中显示为第二个不高但很宽的峰；此时期细胞开始复制到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程；
3. G2/M期：流式检测结果图的第三个峰。G2期是DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA；M期是细胞分裂的过程，此时细胞内是二倍DNA，无法与G2期分开，所以报告为G2/M期。
数据分析区（右侧红方框）
1. 各时期比值：Dip G1-45.66% at 49.04表示G1期DNA含量平均值为49.04（2N），占细胞总数的45.66%。同理，Dip G2-15.12% at98.08则表示G2期DNA含量平均值为98.08（4N），占细胞总数的15.12%。以此类推，可以得知S期和G2/G1期的百分比；
2. CV：表示峰的变异系数，一般CV越小，峰形越好，越尖锐；能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就被认可了。
3. Debris：表示细胞碎片，越少越好；
4. 其他：Aggregates：表示细胞聚集体;Modeled events：表示仪器检测到的总细胞数；All cycle events：表示在细胞周期中分析的细胞数（即排除了细胞碎片和聚集体）
举例：如常用于研究药物或者基因等对细胞周期阻滞的影响
通过比较Control组和药物组，发现化合物影响乳腺癌细胞系MDA-MB231的细胞周期分布，处理组的G2/M期峰值变高，即G2/M期细胞数量增多，即药将其阻滞在G2/M期。注：对于未处理的细胞一般都是分裂间期时间比分裂期长，即G1-S期＞M期。
药物处理MDA-MB231细胞后的周期分布图[2]
常见问题解答
是否可以直接用70~75%的乙醇固定细胞？
不可以，直接70~75%乙醇加入很容易导致细胞聚团现象，很难重悬成单细胞，影响固定效果，甚至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。正确做法是：待细胞充分分散成单细胞后，缓慢地滴入无水乙醇中，使其终浓度为70~75%乙醇。
上机细胞量过少，无法获得数据结果？
1. 首先，要保证收集足够的细胞样品（个人经验至少收集100万左右）；如果药物处理后细胞死亡过多，应该降低药物浓度；
2. 其次，固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞，再逐滴滴入无水乙醇中；
3. 细胞清洗时，不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片；
4. 最后，尽量采用尖底的离心管和水平的离心机，离心后尽量用移液枪吸走上清，不要倾倒，残留一点，不要吸完；
什么样的数据结果可以用？
1. G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍，在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰；
2. CV(变异系数)表示峰的宽度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被认可。
3. RCS最好是在1~3，高于5则不被认可。RCS高，说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大，可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好，或者是PI的浓度不佳造成的。
在实验操作过程中，如何提高G0/G1峰分辨率和精确度？
变异系数（Coefficient of Variation，CV值）反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品CV值为样品固有，与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分，可以减少样本的CV值，提高G0/G1峰分辨率和精确度。
在实验操作过程中，为什么无论如何都无法拟合出周期？
药物毒性过大造成大量细胞死亡或打乱整体周期导致无法拟合特征峰，需要注意的是，药物处理时间最好大于细胞的一个完整周期，这样有助于形成显著的周期阻滞。也可以在加药前使用无血清培养基饥饿细胞6-12h，实现细胞周期同步化。
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