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什么是EMSA凝胶迁移实验？
1. EMSA凝胶迁移实验背景：在分子生物学研究中，理解蛋白质和核酸（DNA&RNA）之间的相互作用是揭示基因调控机制的关键。转录因子等DNA结合蛋白质在基因的转录前调控中扮演着重要角色，它们通过与特定的DNA序列结合，激活或抑制目标基因的转录。类似地，RNA结合蛋白（RBPs）在基因的转录后调控中也扮演着关键角色，通过与特定的RNA序列结合调控RNA的剪接、运输、翻译和降解。在通过上游实验找到了候选的蛋白质和核酸后，通常要对其互作情况进行验证，验证的方法有多种，其中体外验证的方法最为常见和经典是凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA），又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验。
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EMSA凝胶迁移实验原理是什么？
1. EMSA凝胶迁移实验的实验原理：EMSA技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合，再进行PAGE电泳，结合了蛋白质的复合物电泳的速度会变慢（凝胶延滞），这样，从PAGE电泳结果就可以判断，该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和特定蛋白结合。
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EMSA凝胶迁移实验有哪些应用？
1.EMSA凝胶迁移实验的的应用：
（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；
（2）可用于DNA定性和定量分析；
（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
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EMSA凝胶迁移实验有哪些分类？
1. EMSA实验根据实验方案设计的不同，分为验证型EMSA、竞争型EMSA、超迁移EMSA。
（1）验证型EMSA
用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。
探针与纯化蛋白混合孵育，探针与蛋白结合与否，可以直接表明探针和蛋白的互做关系。蛋白提取液中蛋白质混杂，种类不单一，探针可能与多种蛋白结合。因此，探针与蛋白提取液混合孵育，可以验证探针上是否含有蛋白结合位点，但是无法得知是何种蛋白与探针结合。
（2）竞争型EMSA
与探针序列相同，不含修饰基团的DNA片段称为冷探针。
在探针与蛋白质混合液中加入大量冷探针，冷探针含有和探针相同的DNA序列，会干扰探针与蛋白的结合。在电泳图的相应位置处，电泳带的的信号减弱或消失。
探针和蛋白的结合未必是特异性结合，或者蛋白本身可能含有生物素，二者均能产生假阳性的实验结果。增加一个冷探针的干扰实验，可以排除假阳性结果，增加实验结果的准确性。
（3）超迁移EMSA
超迁移EMSA利用到了与待检测的目的蛋白特异性结合的抗体。
如果蛋白质溶液不是单一的纯化蛋白，无论是验证型EMSA，还是竞争型EMSA，都无法证明和探针结合的蛋白质就是我们所预期的。在实验体系中引入特异性抗体，用抗体特异性地结合蛋白-探针复合物，这就是超迁移EMSA。
蛋白-探针复合物被抗体识别z并结合，该三聚复合物在凝胶电泳中，迁移速率再次增大，电泳带出现在蛋白-探针复合物的上方。
超迁移EMSA是以竞争型EMSA为基础的实验方案。超迁移EMSA的实验结果可以很好的验证探针是否和蛋白结合，是否是特异性结合，与探针结合的蛋白是否是预期的蛋白质。
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EMSA凝胶迁移实验的主要流程
1. 目的蛋白表达纯化——探针合成与标记——蛋白与探针孵育——PAGE电泳——转膜——紫外交联——显影。（对于RNA EMSA来说，由于RNA的性质，因此在实验时需要注意RNA降解的问题，因此相较于DNA EMSA更难一些。）该实验原理看似简单，但步骤繁杂且假阳性与假阴性率均较高，针对不同蛋白需要仔细摸索最适实验条件，才会得到漂亮的且可稳定重复的结果。
2. EMSA凝胶迁移实验的结果图怎么看：
（1）第1组阴性对照反应：仅用标记探针跑电泳。理论上探针的位置应该位于最下方；
（2）第2组常规反应：目的蛋白＋标记探针。验证目的蛋白是否和探针结合。
（3）第3组探针冷竞争反应：目的蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针。先用未标记的探针去和蛋白孵育，通常探针都是过量的，理论上目的蛋白全部会与未标记探针结合，多下来的蛋白，肯定就是不能跟这段探针序列结合了。其它蛋白再加入标记的探针，就没有目的蛋白可以与之结合了，而这一组探针的冷竞争反应的对照就是说明，这段探针序列是跟目的蛋白特异结合的，而不是说能跟任何蛋白结合。
（4）第4组突变探针的冷竞争反应：目的蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针。按照假设目的蛋白和探针序列相结合，突变的探针应该不能和目的转录因子结合，同样也说明结合是特异性的，而不是说随便一段探针就能够与目的蛋白结合。
（5）第5组Super-shift反应：目的蛋白＋标记探针＋目的蛋白的特异抗体。目的蛋白和抗体结合后，因为其形成的复合物分子量更大了，在电泳中迁移速率下降，就会有super-shift。如果没有，说明是其他的蛋白和标记探针结合。
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EMSA凝胶迁移实验的优点和局限
1. 优点
作为一种定性技术应用，EMSA最适合检测单一蛋白和核酸的特异性结合。EMSA操作步骤简单、实验周期短、灵敏度高，能真实模拟蛋白质与核酸在体内互作的机制与过程，数据重复性好。
2. 局限
无法呈现复合物中存在的蛋白质的分子量。在处理未纯化或部分纯化的细胞提取物时，它们含有许多核酸结合蛋白，因此，需要进行与EMSA互补的其他技术，以阐明哪种蛋白质导致了电泳迁移率转变。
竞争探针可能与感兴趣的蛋白质结合，这将导致特异性结合降低。为了避免竞争探针的非特异性结合，需要在结合缓冲液中加入poly d(A-T)、poly d(I-C)或其他DNA。
电泳过程中蛋白-探针复合物若发生快速解离，将检测不到结合条带，但这并不意味着蛋白质不会与DNA结合。
温馨提示
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