转染是细胞实验中广泛使用的技术，通过转染可将外源核酸（DNA、RNA等）引入细胞，从而对基因的产物或其功能进行研究，是基因编辑细胞构建必不可少的步骤。
按照转染的原理，细胞转染的方法大致可分为物理介导（如电穿孔法、显微注射法、基因枪法）、化学介导（如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、阳离子聚合物介导法等）和生物介导（主要是各种病毒）三类。其中实验室常用的主要有化学介导的脂质体法、物理介导的电穿孔法和生物介导的慢病毒法。今天，小编主要给大家介绍一下实验室最常用、最方便的转染方法-脂质体法的实验操作步骤及注意事项。
01
脂质体法转染细胞的原理
脂质体通过表面的正电荷与核酸磷酸基团的负电荷相互作用形成内包DNA分子的复合物，复合物表面带正电，会被带负电的细胞膜所吸附，进而通过融合或细胞内吞完成外源DNA分子的导入。具体过程分为以下几步：
①转染试剂与核酸在体外孵育时形成带正电荷的复合物。
②复合物被添加到细胞中，通过静电相互作用与带负电的细胞表面结合。
③细胞通过内吞作用将复合物内化到称为内体的膜囊泡中。
④转染试剂使内体膜不稳定。
⑤复合物从内体中逸出并在细胞质中释放核酸（siRNA、miRNA 或大RNA通常在细胞质中具有活性）。
⑥DNA 必须定位于基因表达和转录的细胞核。
02
脂质体法转染细胞的步骤
脂质体法转染细胞的具体步骤：
1.细胞培养：将细胞培养至适合转染的状态，通常是细胞生长至70-90%的汇合度。
2.转染前准备：准备转染试剂和质粒DNA。如果使用无血清条件下的转染，需准备无血清培养基。
3.转染试剂与DNA混合：按照试剂说明书比例，将转染试剂与质粒DNA混合在适当的缓冲液中。轻轻混合并在室温下孵育一定时间，让转染复合物形成。
4.转染复合物加入细胞。
5.将转染复合物加入含细胞的培养皿或板中。 轻轻摇匀，使转染复合物与细胞均匀接触。
6.孵育：将细胞在培养箱中孵育一定时间，通常为4-6小时或更长时间，以促进转染复合物进入细胞。
7.更换培养基：转染后更换为新鲜的完全培养基，以减少转染试剂对细胞的潜在毒性。
8.转染效率评估： 在转染后24-48小时，通过显微镜观察细胞形态，评估转染对细胞的影响。使用荧光显微镜检测报告基因（如GFP）的表达，评估转染效率。
9.收集细胞实验操作：根据实验目的，进行蛋白提取、RNA提取、细胞增殖等后续操作。
10.数据分析：对实验结果进行收集、分析。
03
细胞转染的注意事项
细胞转染过程中需要注意的事项：
1. 细胞状态和密度：
转染前细胞的状态和密度都非常影响转染效率和后期的实验结果。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。
细胞状态不好，会导致转染效率低下，为确保良好的细胞状态需注意以下几点：
①选择传代次数较低并处于对数生长期的细胞进行转染。
② 细胞密度（%汇合度）达到60%-80%时，再进行转染，此时转染效率较高。切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。
③同时注意在转染后收细胞时的密度不要过爆。因为细胞长的过爆严重影响细胞的状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）从而影响实验结果。一般为前一天下午铺板，第二天上午进行转染，48小时候收细胞进行功能检测。
④细胞污染也会造成转染效率低下，应注意防止细胞污染。
2. 使用优质DNA：
DNA的质量影响转染效率：
①脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA的纯度差，则其携带的少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的效率。
②含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。
为实现高效率、低毒性的转染，应使用高质量的DNA（高纯度、无菌、无内毒素）。
①使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
②通过测量OD值来确定DNA纯度和浓度，OD 260/280 值应介于1.7-1.9之间，越接近1.8越好。读数小于1.8，表明样品可能被芳香族产物（即苯酚）或蛋白质污染；读数大于2.0，则表明样品被RNA污染。
③当转染的DNA会编码对细胞有毒害作用的产物时，可使用弱启动子或可诱导的启动子限制毒性基因产物表达对细胞造成的损害。
3. 选择合适浓度的DNA：
不同细胞系转染效率通常不同，需要进行预实验，选择合适浓度的DNA，以获得较高的转染效率。转染时各种培养皿添加质粒和脂质体参考量见下表：
4. 转染时，小心轻柔的将脂质体加到培养基中并轻轻混匀，避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。
5. 血清：
血清一度曾被认为会降低转染效率，目前对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率。脂质体转染过程中不是必须使用无血清培养基，因为血清中的蛋白质可能会影响复合体的形成。一旦复合体形成，即可将其加入到含血清培养基的细胞中。
6. 培养基：
不同的细胞或细胞类型都有非常特定的培养基、血清、补充剂要求，选择最适合细胞类型的培养基和转染方法在转染实验中起着非常重要的作用。一些细胞系和原代细胞可能需要特殊的包被材料（如多聚赖氨酸、胶原蛋白、纤连蛋白等）以附着于培养板并获得最佳的转染结果。可参考已发表文献或细胞来源处获得针对特定细胞类型的合适培养基和转染方法，如果没有相关信息，则需要根据经验或筛选实验确定。
7. 抗生素：
一般用于瞬时转染的培养基中可含抗生素。不过，由于阳离子脂质体试剂可增加细胞通透性，因此也可能增加递送到细胞内的抗生素量，从而导致细胞毒性以及较低的转染效率。因此不建议在转染培养基中加入抗生素。可在转染前铺板细胞时，使用无抗生素的培养基。
对于稳定转染，不应在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是选择性抗生素的竞争性抑制剂。在构建稳定的细胞系时，在转染程序后预留 48-72 小时供细胞表达抗性基因，之后再加入选择性抗生素。
8. 转染完成后需要对转染效率进行检测，常用的转染效率检测方法有以下几种：
设置阴性和阳性对照：一般在转染后24-48h，靶基因即在细胞内表达。可依据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测等实验。
①使用荧光显微镜或流式细胞仪可以测定转染细胞和 GFP 蛋白表达细胞的百分比。利用含 GFP 或 RFP 之类报告基因的质粒作为阳性对照（阳性对照可以放在一个单独的孔中，或是与目的质粒共转染），评估转染效率。
②利用 qPCR 法精确定量目的基因。
③WB检测敲减或者过表达蛋白。
04
细胞转染的常见问答
1. 转染后发现转染效率不高，可以怎么办？
① 复转染，即转染后12-24小时再次进行转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。
②通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。
2. 转染后细胞死亡的原因有哪些？
①DNA量太高。
②阳离子脂质体试剂量太高。
③在转染过程中使用抗生素：在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂会使细胞更敏感。
④细胞量太少。
⑤在无血清条件下细胞活性降低：使用OPTI-MEM培养基。确保在不存在血清的条件下形成复合物。
⑥阳离子脂质体试剂被氧化：不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂，这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。
⑦对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快：在加入筛选性抗生素前至少预留24-48h使细胞表达抗性基因。
3. 悬浮细胞怎么进行脂质体转染？
悬浮细胞通常是当天按实验所需细胞量接种细胞，后续配制转染复合物，将转染复合物滴加到培养基中，根据摸索好的转染时间，收样检测。
4. siRNA转染通常可以在细胞内维持多久？
siRNA转染通常可以维持1-3天左右，具体时间以siRNA和转染试剂为主。
5. P3000试剂是和质粒加在一起还是和lip3000加在一起？P3000是和质粒一起混合孵育，作用为促进质粒入核。转染siRNA时不加入P3000。
6. 目的基因PCR的CT值在33左右是不是不适合做siRNA？
内参基因表达量正常，目的基因PCR的CT值在33左右，证明该基因的表达量很低，不建议做siRNA。
温馨提示
转染是细胞实验中广泛使用的技术，通过转染可将外源核酸（DNA、RNA等）引入细胞，从而对基因的产物或其功能进行研究，是基因编辑细胞构建必不可少的步骤。如果您科研实验中想要进行细胞脂质体转染，但您正赶上时间紧任务重，没有时间做这部分实验，那不妨找舍为斯生物聊聊吧~舍为斯可为您提供全方位、定制化服务！
联系电话:15302060382(贾经理)
