相分离和铁死亡是当前研究的热点。今天，小编带你一起探讨一篇发表在Nature上的文章，它揭示了相分离如何促进铁死亡的过程。令人惊讶的是，这两个各自领域的独立概念竟然能够相互关联。
铁死亡（ferroptosis）：一种铁依赖性的细胞死亡形式，其特点是由氧化应激引起的脂质过氧化。文章研究铁死亡抑制蛋白FSP1的相分离与铁死亡的关系。
相分离（Phase Separation）：一种细胞内部发生的物理过程，使得细胞质或细胞核内形成不同相态的区域，无需膜分隔。这种分隔使得细胞能够在没有明确界限的情况下组织其内部成分，促进或抑制特定分子的相互作用，影响各种生物学过程和信号传导。相分离过程可由物质生理状态或环境条件的改变触发，如温度、离子浓度和PH等。
铁死亡抑制蛋白-1（FSP1）：是独立于半胱氨酸-谷胱甘肽（GSH)-谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4）轴的第二个铁死亡抑制系统。它与线粒体外泛醌或外源维生素K和NAD(P)H/H+共同作用，能有效防止脂质过氧化。它是一种铁死亡抑制蛋白。
icFSP1触发铁死亡
为了确定体内FSP1特异性抑制剂对抗难治癌症的效果，作者进行了小分子文库筛选，鉴定出icFSP1（3-苯基喹唑啉酮类化合物）作为FSP1的有效抑制剂。
结果显示，icFSP1处理导致HT-1080和TAM诱导的GPX4敲除MEF细胞显著的脂质过氧化和铁死亡。此外，相比于iFSP，icFSP即使在较高的浓度并没有表现出脱靶效应，而且并没有表现出与GPX4抑制剂的协同效应，因此，icFSP应该是FSP的选择性抑制剂。
icFSP1通过诱导凝聚物形成间接抑制FSP1
此外，作者开始探究icFSP1的作用机制。作者使用体外重组的hFSP1测量FSP活性。结果显示，在低浓度条件下，icFSP1不会抑制FSP1酶活性。这表明，与iFSP1相比，icFSP1通过不同的机制抑制hFSP1活性。
作者推测icFSP1可能改变hFSP1的亚细胞定位，使其从脂质膜中解离，从而阻止其对铁死亡的抑制作用。为了验证这一假设，作者构建了稳定表达融合了EGFP和streptavidin的hFSP1蛋白的Pfa1细胞。荧光成像显示，icFSP1可以显著改变hFSP1-EGFP-Strep的亚细胞定位，形成明显的细胞凝聚物，并且这些凝聚物在细胞中具有时间依赖性。
接下来，为了确定hFSP1亚细胞定位的改变是否能够诱导铁死亡，作者构建了稳定表达融合了BFP的hFSP1蛋白的GPX4敲除细胞系。活细胞成像显示，当细胞质膜上的hFSP1-BFP信号减弱时，细胞核内的信号增强。此外，处理表达hFSP1-BFP的细胞系时，icFSP1导致细胞内脂质过氧化的增加，最终导致细胞膜破裂。这些结果表明，FSP1亚细胞定位的改变先于脂质过氧化和铁死亡的发生。
icFSP1 诱导 FSP1 的相分离
作者观察到，在处理后的细胞中，icFSP1 可引发 hFSP1 凝聚物的动态移动和融合现象。并且，当 icFSP1 被去除时，这种现象可以逆转。荧光漂白恢复实验（FRAP）结果显示，只有早期阶段的 hFSP1 凝聚物具有 FRAP 特性，而晚期阶段则没有。
基于 hFSP1 的液滴特性，研究人员推测 hFSP1 凝聚物可能涉及相分离过程，并且在无细胞系统中 hFSP1 倾向于形成凝聚物。实验结果表明，纯化的 hFSP1 与 10% PEG 混合时形成粘弹性物质，进一步验证了 hFSP1 具有相分离形成凝聚物的特性。
FSP1凝聚物是液滴
已知相分离过程可以导致无膜隔室的形成，这对于内在无序区（IDRs）和低复杂性区（LCRs）的多价相互作用至关重要。在 hFSP1 的序列中，相分离预测器揭示了两个IDR和一个LCR的存在，这些区域可能是形成相分离凝聚物所必需的。为了进一步研究，研究人员构建了 hFSP1 的截断体和已知的突变体，包括 G2A 突变体：豆蔻酰化缺陷突变体，影响 hFSP1 的定位和已知的铁死亡抑制功能；Lyn11-G2A 突变体：将 FSP1G2A N端融合到膜靶向的 Lyn11 序列的突变体。
实验结果显示，在 icFSP1 处理后，只有 WT 和 Lyn11-hFSP1G2A 突变体改变了亚细胞定位，并形成凝聚物。此外，在存在 PEG 的条件下，只有 WT 和 Lyn11-G2A 突变体形成了凝聚物。另外，纯化的 myr-FSP1（豆蔻酰化-FSP1）在存在 PEG 和低盐浓度以及 icFSP1 的共同作用下也能诱导相分离。这表明豆蔻酰化修饰可以促进聚合物的形成。而且，只有 WT 和 Lyn11-G2A 突变体具有铁死亡抑制作用，这表明 IDR 和 LCR 可能是 hFSP1 的铁死亡抑制功能所必需的，icFSP1 诱导的铁死亡是由 hFSP1 通过相分离形成凝聚物来触发的。
icFSP1在体内抑制肿瘤生长
研究人员尝试评估 icFSP1 是否可以在体内应用，进行了代谢稳定性和药代动力学分析。结果显示，icFSP1显著促进小鼠微粒体的稳定性，在小鼠血浆中达到了最大浓度。此外，icFSP1能明显抑制肿瘤细胞的生长，而不影响小鼠体重；促进了 hFSP1 凝聚物的形成、4-HEN 的免疫反应以及脂质过氧化物的产生。因此，icFSP1 可能通过触发 hFSP1 的相分离过程并抑制肿瘤生长。
最后，为了验证 icFSP1 在人体环境下是否有效，研究人员使用人黑色素瘤细胞系 A375 和人肺癌细胞系 H460，这些细胞系已知表达大量 FSP1 蛋白，并且在 GPX4 蛋白敲除后仍能存活。实验结果显示，GPX4 敲除的细胞和小鼠对 icFSP1 显示高度敏感，可以抑制肿瘤生长。因此，hFPS 特异性抑制剂 icFSP1 可以触发 FSP1 的相分离，并与经典的铁死亡抑制剂产生协同作用。
小结
研究人员报告了一类尚未被识别的体内有效的 hFSP1 抑制剂，称为3-苯基喹唑啉酮。这些抑制剂表现出独特的作用机制，通过与 FSP1 的相互作用，触发涉及相分离的 FSP1 缩合物来引发铁死亡。
此外，研究人员还发现了一类有效的人FSP1抑制剂，其中以icFSP1为代表的3-苯基喹唑啉酮。与直接抑制FSP1酶活性不同，icFSP1通过引发FSP1的重定位和相分离来触发铁死亡。体内实验证明，icFSP1能够显著抑制肿瘤生长，并在肿瘤组织中形成明显的FSP1凝聚物。此外，icFSP1没有显示出脱靶活性，在高浓度下也不会对体重产生影响。因此，这表明FSP1是肿瘤治疗中一个具有巨大潜力的靶点。
温馨提示
舍为斯生物可为您提与相分离相关创新性的模块化综合性实验服务，如有相关需求，欢迎您随时联系我们。
联系电话:15302060382（贾经理)
